LE SPERMATOZOIDE

C’est toujours le résultat de l’analyse spermiologique qui impose la technique d’AMP à utiliser dans le couple infertile, que la stérilité soit d’origine masculine, féminine ou mixte.
En plus de l’analyse de première intention qui porte essentiellement sur l’évaluation de la qualité et de la quantité du sperme (numération, mobilité, morphologie), on sera amené, dans un certain nombre de cas, à effectuer des analyses complémentaires permettant d’affiner le diagnostic.

II.1  Origine du spermatozoïde

Les cellules souches ( spermatogonies ) apparaissent très tôt dans le développement embryonnaire et restent inactives jusqu’à la puberté.
A la puberté , la formation des spermatozoïdes va commencer :  c’est la spermatogénèse qui dure environ 74 jours (51+23, voir figure ci dessous) pour donner un spermatozoïde fonctionnel. C’est pendant cette période que la spermatogonie passera de l’état de spermatocyte primaire diploïde (à 46 chromosomes) à l’état de spermatocyte secondaire puis de spermatide haploïde (23 chromosomes) après avoir subit une méiose faite de 2 divisions successives  : division réductionnelle suivie de division équationnelle.

La spermiogénèse :

A partir du spermatide, il faudra 24 jours pour que le spermatozoïde se transforme pour devenir fonctionnel et rejoindre la lumière des tubes séminifères..
ce spermatozoïde ne comporte encore aucun pouvoir fécondant et va subir les dernières étapes de son développement tout au long de son trajet dans l’épididyme. Cette maturation comporte l’achèvement de la formation de l’acrosome et l’acquisition de la mobilité.

II.1.1  Les produits toxiques pour la spermatogénèse
– (liste non close)

- Médicaments :
La plupart des médicaments utilisés en chimiothérapie.
Certains médicaments traitant l’hypertension (Aldomet, catapressan….), l’hyperlipémie (lipur, lipanthyl…), le glaucome, la maladie de crohn,(salazopyrine….) les infections (bactrim, eusaprim, furadantoine), certains anti-ulcéreux et antidépresseurs, des hormones (oestrogéniques ou progestatives ( farlutal) des médicaments « anti-hormones » comme l’androcur.

- Substances addictives :
  Alcool, Tabac, drogues…

- Toxiques industriels ou environnementaux, :
Certains métaux lourds (manganèse, plomb, mercure…), certains  dérivés organiques contenant des halogènes (chlore, brome)
Pesticides, herbicides…
Certains Produits fabriqués ou utilisés par l’industrie (produits chimiques, solvants, colles, produit de charge…
Sulfure de Carbone, éthers de glycol, carbamates…

- Facteurs physiques :
Les radiations
la chaleur sous tous ses aspects : bains chauds répétés, sauna, position assise permanente (informatique, conduite professionnelle...).

Le liquide spermatique
Le sperme est constitué, d’une part, d’une suspension concentrée de SPZ baignant dans un liquide épididymaire et, d’autre part, de différente sécrétions complexes provenant des organes annexes : prostate, vésicules séminales, glandes de Cowper.

Le liquide spermatique est constitué approximativement de :
20% en provenance des sécrétions épididymaires et des glandes de Cowper
20% en provenance de la prostate
60% en provenance des vésicules séminales

Caractéristiques des différentes sécrétions
Dans un premier temps (contraction musculeuse prostatique) les spermatozoïdes, dilués dans le liquide prostatique donnera une suspension riche en spermatozoïdes à pH acide. pH = 6,4
Aussitôt après, (contraction secondaire) La sécrétion des vésicules séminales se fera en dispensant un liquide pauvre en spermatozoïdes en pH alcalin. pH = 8,2
Le résultat final donnera un mélange blanchâtre et opalescent de sécrétion à pH neutre, contenant la totalité des SPZ.

Le volume normal se situera entre 2 et 4 ml. (OMS 2010 : valeur basse 5e percentille : 1,5 ml) et le pH final après mélange des différentes sécrétions se situe entre 7,2 et 7,4 UpH.

II.1.2  Le spermatozoïde fonctionnel

 
1 : Acrosome
2 : Noyau (chromatine condensée)
3 : Centriole distale
4 : Centriole proximale
5 : Mitochondries
6 : Axonème
7 :  Fibres denses externes

II.2  Analyse du sperme humain

II.2.1  Recueil du sperme

Pour effectuer une analyse du sperme, ou un recueil en vue d’une technique d’AMP, le délai d’abstinence peut être raisonnablement de 2 à 4 jours sans toutefois dépasser une semaine.
Le recueil se fera au laboratoire ou à la clinique, selon les cas, après une toilette intime soignée.
La liquéfaction du sperme se fait normalement en 30 minutes à 37°C. ou une heure environ à température ambiante. Il peut exister des anomalies de liquéfaction qui doivent être notées et qui pourront, dans certains cas, obliger à utiliser des techniques physiques de liquéfaction pour pouvoir faire une analyse correcte.

II.2.2  Spermoculture
Elle sera systématiquement effectuée en cas de prévision de technique d’AMP.
La mise en culture sera  le premier geste à faire si une spermoculture doit être pratiquée.
Elle devra se faire rapidement en cas de recherche de N. Gonorrhoeae (gonocoque).

Les germes habituellement recherchés :
- Les germes aérobies -  et anaérobies (Bacteroides, bifidobactéries, fusobactérium, lactobacille, peptococcus…) si l’on recherche une infection des glandes annexes (prostatite notamment) ,
- Les mycoplasmes, les chlamydiae, Les gonocoques, …M. Tuberculosis.

Pour les germes potentiellement pathogènes (Enterobacter, E.Coli, Proteus, Klebsielles…), on considérera qu’une infection est manifeste pour des concentrations de germes supérieures à 3.000 unités formant colonies par ml : ufc/ml. Une identification et un antibiogramme sont alors pratiqués systématiquement.

Des germes de la flore buccale, cutanée ou urétrale peuvent être présents naturellement dans le sperme, mais on ne tiendra alors compte que des germes en culture pure ou très majoritaire, sous réserve que leur nombre soit supérieur à 10.000 ufc/ml.
Particulièrement pour les germes suivants :
Cocci : Streptocoques alpha hémolytiques, Staphylocoques coagulase(-)
Autres : les Neisseria commensales, les corynébactéries, voire les gardnerella vaginalis.

Enfin, on peut aussi trouver des germes de type nosocomial  comme le bacille Pyocyanique (Pseudomonas aeruginosa)

Une association de plusieurs germes fera plutôt penser à une contamination au cours du prélèvement.

II.2.3  Analyse organoleptique et macroscopique

Elle consiste à observer l’aspect général du sperme, après homogénéisation avec une pipette pasteur, par exemple :
- Etat de la liquéfaction, évaluation de la viscosité, les problémes d'yperviscosité pouvant être en relation avec un problème d'origine prostatique principalement.
- Aspect, couleur, souvent en rapport avec une infection, une réaction inflammatoire ou une hémospermie (sang dans le sperme).

Mesure du volume :

Si l’on n’utilise pas un réceptacle gradué au recueil du sperme, Le volume sera mesuré par transfert dans un tube gradué au moyen d’une pipette en verre (pasteur) ou en plastique à usage unique.
Les valeurs usuelles se situent entre 2 et 6 ml.
Toutes valeurs suspectes devra faire l’objet d’une enquête : problème de recueil ou anomalie pathologique, phénomène infectieux, éjaculation rétrograde….

L’étude du pH se fera sur un indicateur de pH en bandelette papier (échelle de mesure (6-10 unités pH) contrôlé dans l’heure qui suit le prélèvement, à température ambiante, il devra se situer normalement entre 7,2 et 8 unités pH.
Toutes valeurs inférieures à 7 devra faire penser à une dysgénésie des canaux déférents  des vésicules séminales ou des épididymes. Alors que des valeurs supérieures à 8 pourront orienter vers un phénomène infectieux.

II.2.4  Analyse microscopique standard

Elle permet d’analyser les paramètres importants du sperme à un grossissement microscopique de l’ordre de 200 à 400, si possible en contraste de phase pour une visualisation plus confortable, alors que la morphologie des spermatozoïdes sera évaluée à part  à un plus fort grossissement (X 1000) après fixation sur lame et coloration spécifique.

II.2.5  Numération des spermatozoïdes

La numération peut se faire avec un hémocytomètre (Neubauer) :
Sur spermatozoïdes tués :
Soit en diluant le sperme entre 1/10 et 1/50 selon la concentration de départ, et en le colorant avec du bleu trypan.
Soit en diluant le sperme et en faisant une lecture directe en contraste de phase.

La numération peut aussi se faire avec une cellule de Makler, sur sperme chauffé à 50-60°C, sans dilution dans la plupart des cas.

Un sperme normal compte de 15 à 200 millions spermatozoïdes par ml.
En dessous de 40 millions / éjaculat, on parlera d’oligospermie, quoiqu’il est cependant possible d’obtenir des grossesses naturellement avec des concentrations de l’ordre de 5 à 10 millions par ml.
Au dessus de 200 millions/ml. on parlera de polyspermie.
Il est important de faire un rapprochement entre numération et volume spermatique avant de conclure (voir ci-dessus : volume spermatique).

La cryptozoospermie est une forme intermédiaire entre azoospermie et oligospermie où l’on retrouve de temps en temps quelques spermatozoïdes après centrifugation, ( moins de 100.000 par ml. ).

II.2.6  L’Azoospermie est l’absence totale de spermatozoïde sur au moins 2 à 3 prélèvements fait à 2-3 mois d’intervalle. Le diagnostic se fera après avoir pris en compte les observations qui ont été citées dans  le chapitre concernant la mesure du volume spermatique.
Classiquement, il existe 3 types d’azoospermie : l’azoospermie excrétoire, l’azoospermie sécrétoire et l’azoospermie due à un hypogonadisme central.

L’azoospermie excrétoire se définie comme une production de spermatozoïdes sans émission dans l’éjaculat – azoospermie obstructive.
Généralement dans ce cas, le taux de FSH, (d’inhibine) et d’AMH, de testostérone sont normaux mais les constantes biochimiques du sperme sont altérées, en fonction de la localisation de l’obstruction :
Dosage du fructose pour les vésicules séminales
Dosage de la L-carnitine ou de l’alpha-glucosidase pour l’épididyme
Dosage du fructose pour les vésicules séminales
Dosage du zinc ou du citrate pour la prostate :

Dans le cas d’agénésie vésiculo-déférentielle (absence congénitale de vésicule séminale et de canaux déférents), il y a une perturbation caractéristique de la biochimie spermatique :
Une diminution du liquide spermatique à pH acide, une forte diminution du fructose, de la carnitine et de l’alpha-glucosidase.
Une augmentation artificiellement augmentée de la phosphatase acide, du fait que le liquide séminale est principalement constitué de sécrétions prostatiques.
On associera, dans ce cas précis, la recherche des mutations du gène CFTR (mucoviscidose) dans le cas où une technique d’AMP devrait être tentée.

L’azoospermie sécrétoire se définie comme une absence de production de spermatozoïdes.
On trouve généralement une FSH très augmentée (mais aussi quelquefois normale) ainsi qu’un taux d’inhibine effondré.
En dehors d’une azoospermie due à une radiothérapie poussée (sup. à 2 Gy) ou à une chimiothérapie antimitotique prolongée, on pourra retrouver des anomalies du caryotype comme des microdélétions  sur le bras long du chromosome Y (10 à 20 % des cas) ou un syndrome de Klinefelter dont la forme classique (47XXY) représente 90% des cas avec 10 % de mosaïques ou de surcharges chromosomiques.
L’hypogonadisme central , qui peut être primaire ou secondaire et traité généralement par un traitement hormonal substitutif, après avoir éliminé la possibilité d’une tumeur de l’hypophyse.

II.2.7  Numération des autres éléments cellulaires :

 Les cellules rondes

Les cellules rondes englobent un ensemble de cellules d’origine différentes :
Les cellules germinales, à différents stades de développement :

1 -  spermatogonie, 2 -  spermatocyte ordre I,
Leur présence à un taux élevé (sup. à 10% de la numération des spermatozoïdes) reflète généralement des altérations au niveau de la spermiogénèse.
3,4,5 – spermatides partageant ou non le même cytoplasme,
6 – spermatocyte ordre II

Les leucocytes ( à réaction peroxydative Positive) dont le taux doit être inférieur à un million par ml, en l’absence de processus infectieux.
Les  macrophages ou les lymphocytes (à réaction peroxydative négative – coloration de Heintz) . 

II.2.8  Etude de la mobilité

L’étude de la mobilité doit s’effectuer à 37°C (lame préchauffée). Elle doit être rigoureusement faite et renouvelée éventuellement pour retirer au maximum la subjectivité de l’opérateur :
Dépôt d’un échantillon assez riche et bien homogène de 10 microlitres sur une lame de verre que l’on recouvrira, par dépôt horizontal, avec une lamelle de verre de 22 x 22 mm.
Dans ces conditions, l’espace obtenu entre lame et lamelle sera de l’ordre de 20 micromètres. Cet espace est suffisant pour bien observer le mouvement ondulatoire des spermatozoïdes qui évolueront dans cette épaisseur liquidienne.
On peut aussi utiliser des cellules d’observation comme la cellule de MAKLER qui fixe, par construction, un espace de l’ordre de 20 micromètres et qui permet de prendre des repères grâce à sa lamelle pourvue d’un quadrillage gravé :

L’évaluation de la mobilité se fait sur 200 spermatozoïdes. Il existe 3 types de mobilité (OMS-WHO 2010):
- Spz à Mobilité totale (%)
- Spz àMobilité progressive (%)
- Spz immobiles (%)

Selon l’OMS (WHO 2010)un sperme normal contient au moins 40% de spermatozoïdes mobiles (mobilité totale) et/ou au moins 32 % de spermatozoïdes à mobilité progressive (OMS- WHO 2010).

L’asthénozoospermie définie une mobilité diminuée, en dessous des normales données ci-dessus.
Les origines de cette anomalie peuvent être diverses :
- Infection,
- Absence de fructose (dosage possible dans le sperme) liée ou non à une origine infectieuse
- Présence d’auto-anticorps antispermatozoïdes (recherchés par le Mar-test ou le test des immunobilles). Dans ce cas précis l’asthénospermie augmente généralement au cours du temps en relation avec l’augmentation de l’importance des agglutinats de type immunologique.
- Hyperviscosité anormale du liquide séminale, dont la cause est généralement due à une anomalie de la sécrétion prostatique qui contient les enzymes des liquéfaction.
- Anomalies flagellaires (Akinésie, dyskinésie), pouvant être confirmées par une étude cinétique du mouvement (CASA) ou mieux par une étude ultramicroscopique du flagelle.

II.2.9 Etude de la vitalité
La vitalité permet de connaître Le nombre de spermatozoïdes vivants  sur 100 spermatozoïdes observés. Ce pourcentage est particulièrement intéressant à connaître quand le nombre des spermatozoïdes mobiles est  très faible ou nul.

Le test à l’éosine-nigrosine
C’est le plus utilisé. Il s’effectue sur sperme frais.
Il consiste à laisser entrer un colorant dans les spermatozoîdes morts contrairement au spermatozoïdes vivants qui ne fixent pas le colorant.
Après ajout de la nigrosine, les spermatozoïdes vivants apparaissent en blanc alors que les morts apparaissent en rose-orangé sur fond noir.

Le taux de spermatozoïdes vivants est normalement supérieur à 75 %

Test de Hos ou test de gonflement hypo-osmotique
Ce test peut être utilisé aussi pour connaître la vitalité d’un sperme. Son principe est basé sur le fait que la membrane intacte d’un spermatozoïde vivant est semi-perméable et sensible aux phénomènes osmotiques contrairement à un spermatozoïde mort.
L’incubation d’un échantillon de sperme dans un milieu hypo-osmotique permet de visualiser les spermatozoïdes vivants, en analysant les gonflements visibles obtenus au niveau flagellaire.

II.2.10  Le spermocytogramme
Le spermocytogramme permet de connaître le pourcentage de forme typiques (normales) dans un sperme donné. Il faut toutefois savoir que les résultats ne sont pas stable dans le temps et que des variations importantes peuvent survenir dans de nombreuses occasions, comme d’ailleurs pour la plupart des autres paramètres spermatiques.
Le spermocytogramme est pratiquement toujours établi à partir d’un frottis fixé et coloré soit par le réactif de Shorr, ou de Papanicolaou modifiée, soit par des réactifs « rapides » que l’on trouve aujourd’hui sur le marché.
Le réactif de Giemsa peut être utilisé pour rechercher les différents types de leucocytes.

coloration de Shorr
Coloration rapide

Après coloration l’étude se fera par observation de 200 spermatozoïdes selon les critères édictés soit par :

G.. DAVID modifié par J.Auger et F. Eustache - (Andrologie, 2000,10,358-373) – ou, en plus de la description de 17 anomalies possibles, présentées sous formes d’un tableau à entrées multiples, il a été proposé un index d’anomalies multiples (IAM) qui se calcule en divisant toutes les anomalies observées sur chaque spermatozoïde par le nombre de spermatozoïdes observés. Des valeurs d’IAM supérieures à 1,6 sont de mauvais pronostic en fertilité naturelle.
- Dans ces conditions un spermocytogramme est normal si le pourcentage de forme typique est supérieur à 30 %. En dessous de 30 %, on parlera de teratozoospermie.

Spermocytogramme selon S. KRUGER et Coll,
Le spermocytogramme permet d’évaluer la tératozoospermie. Il représente un des éléments majeurs de l’analyse du sperme en première intention.
L’évaluation très stricte de la morphologie des spermatozoïdes selon les recommandations de kruger et Coll. est adoptée aujourd’hui par un grand nombre de laboratoires d’analyses médicales.
Les anomalies sont classées en 4 classes de valeur décroissante :
- Anomalies de la tête (H pour Head dfects)
- Anomalies de la pièce intermediaire (M pour Neck et Midpiece defects)
- Anomalies de la piece principale (flagelle) (P pour principal piece defects)
- Présence de Reste cytoplasmique (C pour Excess residual cytoplasm)

 La grille de paillasse utilisée peut permettre de déclarer toute les anomalies dans chaque classe, mais généralement on ne déclare qu’une anomalie par classe ce qui est en accord avec la détermination  du TZI (TeratoZoospermia Index) dont le calcul impose la prise en compte d’une seule anomalie par classe (Menkveld et Kruger, 1996 – Menkveld et Coll, 2001).

L’analyse du sperme consistera donc a relever pour chaque spermatozoïde, la presence ou l’absence d’anomalie dans chaque classe.
L’absence totale d’anomalie définie le spermatozoïde typique.
La présence d’une anomalie (ou plus) le rend atypique.

Légende :
TETE : - a : allongé (tapered) - b : piriforme - c : ronds sans acrosome, ronds avec acrosome  - d : irréguliers - e : vacuolisé
-f : acrosome réduit.
BASE ET PIECE INTERMEDIAIRE : g., h : désaxés – i, j : anomalies des proportions de la pièce intermédiaire (épaisse, fine).
FLAGELLE : k : court – l : angulé – m : enroulé .
RESTE CYTOPLASMIQUE : n

Dans ces conditions, les normales usuelles sont basses puisque l’OMS définit, dans son guide WHO-2010, les valeurs normales du nombre de formes typiques comme supérieures à 4 % (5e percentile).

Il est important de noter que la valeur du 5e percentile pour cette population montre, par définition, que des hommes fertiles (5 % de la population choisie selon les critères ci-dessus) peuvent avoir des valeurs inférieures à ces seuils.

Selon les résultats obtenu, on distingue 3 « groupes qualité »
- Spermocytogramme "bon pronostic" : Forme typiques sup. à 14%
- Spermocytogramme « pronostic intermédiaire » : entre 4 et 14 %
- Spermocytogramme « mauvais pronostic » : inf. à 4 %

Teratozoospermie

Une teratozoospermie importante, avec oligospermie et qui présente de surcroît un nombre important de cellules rondes (lignée germinale) est le témoin d’une atteinte testiculaire grave dont l’origine doit être recherchée parmi les causes possibles : infectieuse, toxique ou médicamenteuse, varicocèle…

Le futur proche
Avec l’apparition de nouvelles techniques d’observation ( contraste de phase de type Nomarski avec amplification électronique d’image – X6000) le spermocytogramme pourrait prochainement être interprété différemment quand il s’agira d’utiliser des techniques d’AMP du type de la micro-injection magnifiée (voir SICSI).

II.3  Analyses complémentaires

II.3.1  Auto-anticorps antispermatozoïdes – MAR-test

La présence d‘agglutinats dans un sperme liquéfié, à fortiori si ces agglutinats augmentent au cours du temps, peut faire suspecter l’action d’auto-anticorps antispermatozoïdes présents dans le liquide séminal.
Leur recherche pourra se faire à partir de supports sensibilisés par des immunoglobulines humaines (IgG) et activé  par un antisérum monospécifique anti IgG humain.
L’apparition d’agglutinants formé par le support sensibilisé et les spermatozoïdes mobiles permettent de conclure à la présence d’auto-anticorps antispermatozoïdes de type IgG.
Le support sensibilisé peut être constitué d’hématies humaines (groupe O rh+) sensibilisé par une immunoglobuline IgG anti-Rh et activé  par un antisérum monospécifique anti IgG humain (de lapin) servant de pontage.

Ou encore de particules de latex  (immunobilles) capables de réagir, suivant leur composition, sur les anticorps de type IgG ou IgA (ou IgM). Ou IBT-test

Le MAR-test, effectué à partir des hématies sensibilisées peut être effectué facilement et à moindre coût, en cas de positivité on pourra affiner le résultats en utilisant des immunobilles pour chaque catégories d’anticorps.
Un résultat inférieur à 50 % doit être considéré comme négatif, il est positif en dessus de 50 % mais il n’est pas rare de retrouver 100 % de spermatozoïdes ayant fixé des auto-anticorps, ce qui, aujourd’hui, oriente d’emblée vers une fécondation in vitro avec micro-injection (ICSI).
Les anticorps anti-spermatozoïdes peuvent quelquefois être mis en évidence lors d’un test de Hühner où, en leur présence, de nombreux spermatozoïdes ébauchent un oscillement caractéristique en paraissant  accrochés à la glaire (shaking phenomenon) . Ceci est dû à la présence d’IgA.

Les auto-anticorps antispermatozoïdes sont retrouvés, selon les auteurs, dans 3 à 8 % des cas.

Les groupes de patients ayant le plus de chances d’avoir des anticorps anti-spermatozoïdes  Sont ;
Les hommes opérés de hernies inguinales pendant l’enfance
Les hommes avec régression unilatérale ou bilatérale (complète ou partielle) du ductu(s) de Wolffian.
Les hommes vasectomisés
Les hommes avec une histoire d’infection du tractus génital
Les hommes avec agglutination des spermatozoïdes dans l’éjaculat
(Source :Infertilité d’origine immunologique - R.frydman JTA 1994)

II.3.2  Test de fragmentation de l’ADN spermatique

 Au cours de l’éjaculation, la sécrétion prostatique riche en Zinc et associée au reste du plasma séminal protège la chromatine compactée d’une décondensation précoce. Cependant, le spermatozoïde, au cours de sa maturation n’est pas à l’abri de stress délétères (comme le stress oxydatif ) et peut subir des modifications de son ADN incompatible avec la survenue d’une grossesse débutante ou menée à terme.

L’ADN du spermatozoïde, support du génome d’un individu est une longue molécule fragile et fortement compactée.
La forme stable de la chromatine du spermatozoïde (ADN + protéines) est indispensable au processus normal de la fécondation et au développement embryonnaire. Elle dépend des protéines qui y sont associées (protamines et/ou histones). La condensation maximale de la chromatine du noyau des spermatozoïdes éjaculés est liée à la présence des protamines et les défauts de condensation pourraient être à l’origine de certaines formes anormales de la tête ?

Pour des raisons diverses et pas toutes répertoriées aujourd’hui, il peut arriver que les brins d’ADN  se dissocient d’une manière excessive (chaînes bicaténaires + chaînes monocaténaires) : il y a alors fragmentation de L’ADN

Habituellement, La fragmentation est souvent présente en faible quantité dans la plupart des spermatozoïdes mais après fécondation, l’appareil ovocytaire peut contribuer à réparer ces coupures anormales, sous réserve qu’elles se trouvent dans une proportion raisonnable.

Au delà d’un certain seuil, la réparation n’est plus possible, les mécanismes de réparations sont alors dépassés et le développement embryonnaire ne peut pas se poursuivre. (Actuellement, le seuil admis est compris entre 20 et 30 spermatozoïdes fragmentés sur 100 spermatozoïdes observés.

Le  génome paternel, commence à s’exprimer, au delà de 72 heures de culture ( 8 cellules). En cas d’anomalie du spermatozoïde, on pourra constater des problèmes, au tout début du développement embryonnaire, qui se répercuteront plus ou moins tardivement : au moment de l’implantation ou après quelques semaines de grossesse. On retrouve ce phénomène de fragmentation dans un certain nombre de cas : infertilités inexpliquées, fausses-couches à répétition, échecs d’implantation….
Quelques causes peuvent être évoquées aujourd’hui comme, les radiations, les radicaux libres, les infections hautes à chlamydiae, voire à mycoplasmes, le tabac, les composés organochlorés…
 Il y a probablement d’autres facteurs à ajouter à cette liste avec, pour certains des possibilités de réversibilité ?
Les altérations de la spermatogénèse peuvent aussi avoir un impact sur la fragmentation

L’analyse du spermocytogramme ne permet pas de mettre en évidence le phénomène de fragmentation de l’ADN.

Evenson et ses Collaborateurs ont mis au point une méthode d’analyse qui évalue la qualité de l’ADN des spermatozoïdes en cytométrie de flux (technique SCSA : Sperm Chromatine Structure Assay). Mais d’autres techniques peuvent être utilisées en routine comme :
La technique Tunel (terminal uridine nick end labeling) met en jeu une immunofluorescence sur lame ou en cytométrie de flux.
La technique SCD (sperm chromatin dispersion) plus facile à mettre en oeuvre  car elle ne demande pas de matériel spécifique, c’est l’Halosperm screen Test*.

Elles permettent toutes une évaluation du taux de fragmentation de l’ADN. Toutefois les différentes techniques n’abordent pas l’analyse de la fragmentation de la même manière et ne mettent pas en évidence les mêmes impacts de la fragmentation sur l’ADN. Il est donc utile de bien connaître les fourchettes normales de chaque technique qui doivent être rendues avec les résultats.
Une étude complémentaire concernant la standardisation des tests et l’établissement de seuils discriminants fiables est nécessaire, semble t’il, pour bien positionner ces tests.

Interprétation de l’indice de fragmentation :
En règle générale, Un indice sup. à 30% peut déjà expliquer l’échec répété en AMP.

EXAMENS DE SECONDE INTENTION

ETUDE ULTRASTRUCTURALE DES SPERMATOZOIDES
Seule la microscopie électronique permet d'examiner l'ultrastructure de la cellule spermatique, mais c'est une technique nécessitant des biologiste qualifiés dans cette technique.
Elle a été utilisée avec succès dans la recherche d'anomalies structurelles du flagelle (akynésie et dyskinésie flagellaire) retrouvées dans l'observation de sperme à mobilité "glissante" et non productive de mouvements pour un déplacement efficace.
Toutes ces anomalies ne touchent pas les spermatozoïdes à 100 % sauf dans le cas de la maladie des cils immobiles syndrome de Kartagener.

TESTS DE FECONDANCE DU SPERME

I - TEST POST-COITAL (TPC) OU > Test de Huhner

II - TEST DE CAPACITATION
Afin que les spermatozo des soient capables de féconder l'ovocyte, ils doivent, subir un processus de " maturation finale " dans le tractus féminin, dénommé " capacitation ".



la capacitation peut être définie comme le relargage de protéines de revêtement et/ou la transformation des lipides membranaires aboutissant à :
1 - une transformation des caractéristiques du mouvement des spermatozoïdes, en une forme de mouvement caractérisé par une forte amplitude, qu'on appelle " hyperactivation "2 - la fixation et la pénétration de la zone pellucide de l'ovocyte
3 - la réalisation de la " réaction acrosomique ".

III - TEST LA FIXATION SUR LA ZONE PELLUCIDE
Lors de la première étape de la fécondation, la reconnaissance et la fixation de spermatozoïdes sur la zone pellucide sont indispensables pour la réalisation de la suite du processus de fécondation.
Comme la fixation de spermatozoïdes sur la zone pellucide est un processus " spécifique " non réversible, il est donc nécessaire pour la réalisation de ce test, ou de zones pellucides despécifiées de Hamster, ou mieux, de disposer de zones pellucides humaines Celles-ci peuvant être récupérées à partir des ovocytes immatures provenant d'ovaires au cours d'une intervention ou après un échec de FIV.
Un faible taux de fixation des spermatozoïdes sur la zone pellucide pourrait évoquer la présence d'anticorps à la surface de la membrane plasmique du spermatozo de. Aussi, il semble exister une corrélation entre le nombre de spermatozoïdes fixés sur la zone pellucide et les succès de FIV.

IV - TEST DE LA REACTION ACROSOMIQUE
La réaction acrosomique est la fusion des membranes plasmique et acrosomique externe, et la libération concomitante du contenu de l'acrosome résultant de la formation de vésicules entourant la tête du spermatozoïde.
Cette réaction se caractérise un efflux de protons et par un influx de Ca++ à travers la membrane plasmique périacrosomique.
Plusieurs méthodes directes et indirectes sont utilisées pour visualiser à la fois la présence et l'absence de l'acrosome, et la réaction acrosomique. La réaction acrosomique peut être mise en évidence facilement en microscopie à contraste de phase à l'aide de colorants cytologiques (colorants de Talbot, lectines marquées et anticorps monoclonaux .
Réserve :
Il est important de préciser que la valeur de ces tests est relative et mérite d'être interprétée avec prudence dans la mesure où ces tests ont lieu "in vitro".
D'autre part, il est important de distinguer une réaction acrosomique " proprement dite " d'une réaction " dégénérative " au cours du vieillissement et de la mort du spermatozoïde ou à la suite d'un mauvais traitement.

II.5  Sélection des spermatozoïdes en AMP

En dehors des techniques de filtration sur colonne (micro-billes de verre ou albumine), très peu utilisées aujourd’hui, deux techniques sont utilisées en routine, seules ou combinées :
- la sélection par swim-up
- la sélection par gradient de densité
- la sélection par gradient de densité suivi d’ un swim-up

II.5.1   La sélection par swim-up

Cette opération consiste à concentrer, par centrifugation à 300 g. pendant 20 minutes, un sperme dilué au 1/4 dans un milieu de survie.
Le culot, une fois débarassé du surnageant et donc du liquide séminal, sera alors mis à migrer par swim-up ascendant dans un milieu de culture capacitant déposé délicatement à la surface du culot spermatique.
Après migration de 10 à 30 minutes à 37°C., les spermatozoïdes les plus mobiles auront migrés dans la couche supérieure et seront prélevés dans la sous couche la plus riche là où il existe une bonne opacité.

Une autre méthode consiste à faire migrer directement les spermatozoïdes mobiles dans la couche supérieure de milieu de culture, le tout placé dans une étuve à CO2 , si on utilise un milieu tamponné carbonate/acide carbonique.
Les spermatozoïdes sont ensuite récupérés, lavés et centrifugés (300 g. pendant 10 minutes).
Une fois le surnageant décanté, le culot est repris par une petite quantité de milieu de culture neuf capacitant.

II.5.2   La sélection par gradient de densité

La technique utilisant un gradient de densité «double couche» de produits dérivé du Percoll* est la plus utilisée aujourd’hui pour sélectionner les spermatozoïdes. Elle a un certain nombre d’avantages qui sont décrits sur la page suivante.

Dans certains cas, il est possible de terminer la technique par un «swim-up» direct de manière à obtenir un sperme plus propre. cela consiste à faire migrer les spermatozoïdes dans une couche supérieure de milieu de culture neuf déposée délicatement au dessus du culot.
N.B. Il est possible aussi d’utiliser plusieurs couches intermédiaires supplémentaires comprises entre 30 et 90 % en cas de sperme riche en cellules.

II.5.3  Exemple de procédure

Phase 1
Dans un tube stérile de 15 ml. à fond conique distribuer au moyen d’une pipette souple à usage unique :
- 1,5 ml. de solution de puresperm* à 90 % (ou 80%)
Puis déposer délicatement, sur la couche précédente
- 1,5 ml de Puresperm* à 45 %. (ou 40%)
Sur la deuxième couche, déposer délicatement :
- 1,5 à 2 ml de sperme liquéfié et homogénéisé Fermer le tube avec son bouchon et centrifuger pendant 15 à 20 minutes à 400 g.

Phase 2
Aussitôt la centrifugeuse arrêtée, éliminer par aspiration les 2 couches supérieures ainsi que la partie haute de la couche du fond (Puresperm 90%).

Phase 3
Selon les cas :
IAC : Transférer le culot dans un tube de 5 ml stérile à bouchon flottant contenant 3 ml. de milieu de culture , homogénéiser et centrifuger 10 minutes à 2/300 g.. Aspirer le surnageant jusqu’au dessus du culot de sperme. Diluer le culot avec 300 à 400 microlitres d’un milieu de culture capacitant, Homogénéiser , compter et transvaser dans le microtube de transport.

FIV, ICSI, IMSI, selon les cas :
- Laver le culot avec du milieu de culture frais et centrifuger à nouveau
- Eliminer le milieu de culture surnageant et diluer le culot ou effectuer un swim-up selon les besoins.

II.5.4  Comparaison des Techniques : SWIM UP - Gradient de densité

 II.7  LA CRYOCONSERVATION DU SPERME HUMAIN

La cryoconservation du sperme humain est une technique pratiquée depuis plusieurs décennies.
Avant d’être congelé, le sperme devra subir l’action de mélange à base de  cryoprotecteur  qui permettra une cryoconservation optimale.
Plusieurs kits prêts à l’emploi permettent d’obtenir de bons résultats, sous réserve, bien sûr, que l’on est contrôlé la qualité du sperme avant congélation.
Le mélange  de dilution du sperme le plus utilisé est à base de glycérol. La répartition du mélange se fait habituellement dans des paillettes de 250 microlitres avec une concentration finale de glycérol autour de 7 %.
Généralement on conservera une ou 2 paillettes de sperme pour contrôler la mobilité résiduelle après décongélation. Celle ci peut être très variable et dépend essentiellement de la qualité du sperme avant congélation. On peut escompter retrouver 50 % des spermatozoïdes mobiles dans les cas favorables.

On utilisera généralement un programmateur pour faire descendre la température par paliers successifs :
De + 20°C. à - 4°C.                     :  -   5°C./ mn
De - 4°C à -30°C.                        :  - 10°C./ mn
De - 30°C. à -140°C.                   :  - 20 °C./ mn

La conservation du sperme est stable pendant au moins 10 ans.

La décongélation du sperme se fait généralement en immergeant la paillette dans de l’eau à 37°C. pour avoir un réchauffement rapide.

Des techniques de conservation du sperme par vitrification ont aussi été proposées.

Les principales indications d’auto conservation du sperme sont:
- L’Autoconservation du sperme en vue d’AMP, en cas d’OATS à recueil aléatoire.
- L’Autoconservation du sperme après une ponction épididymaire ou testiculaire
- L’Autoconservation du sperme avant un traitement anti-cancéreux .

II.7.1  Le don de sperme

En France, il est réglementé, tout comme le don d’ovocytes, aux seuls établissements autorisés. Le don de sperme est actuellement gratuit et anonyme. Il passe obligatoirement par une étape de congélation (contrôle sanitaire et stockage.

En savoir plus sur la spermiologie :
Article "grand public" : Qu'est ce qu'un spermatozoïde ?
Le spermocytogramme
L'azoospermie
Les nouvelles méthodes d'investigation