Biologie de la Reproduction - Techniques de Procréation Médicalement Assistée

Milieux de culture, Milieux de préparation du sperme, PVP et dérivés, Hyaluronidase, huile stérile...
Cette liste n'est pas close, Vous pouvez nous contacter par mail ou par courrier, pour ajouter de nouveaux produits ou de nouvelles rubriques

LA CULTURE CELLULAIRE - GENERALITES

Les conditions de culture des gamètes et des embryons sont asservies à un certain nombre d’impératifs:

A - La qualité de l’air

La qualité de l’air est considérée aujourd’hui comme un facteur déterminant de réussite dans un laboratoire pratiquant l’A.M.P.
Ce problème doit être traité, si possible, à la construction du laboratoire.
Cependant, si le laboratoire est déjà construit on pourra utiliser des modules mobiles de filtration, a fortiori, si l’environnement du laboratoire, ou de la clinique, est sensible ( poussières, vents, circulation automobile....)
Les Tours filtrantes CODA* sont un bon exemple de tours mobiles adaptables à tous les volumes de laboratoire, elles disposent de 2 types d’action :
- Elles filtrent les particules solides et les micro-organismes.
- Elles filtrent les composés organiques volatils : COV - (VOC en anglais) dont certains ont des actions très délétères sur la fécondation in vitro

B -  La température

1–Le laboratoire.
La température du laboratoire devra permettre au personnel de travailler confortablement avec cependant une limite haute à ne pas dépasser (27°C), ceci afin de permettre aux différents incubateurs de pouvoir effectuer leur régulation dans des bonnes conditions.

2 - Manipulation des gamètes
En ce qui concerne la température de travail des gamètes Elle devra être maintenue en permanence à 37°C, en évitant les chutes brutales de température.
Pour maintenir une chaîne du chaud, on pourra utiliser :
- soit une batterie de platines chauffantes, sur microscope, loupe binoculaire, etc...
- soit une paillasse chauffante intégrée dans la paillasse de travail qui permet d’effectuer toutes les opérations en continu, sur le même espace.La température des platines chauffantes et des incubateurs sera régulièrement vérifiée avec un thermomètre de référence, et ajustée si besoin.
Le contrôle se fera en «situation» de travail (hotte K-system)

C - La stérilité

Elle est assurée dans l’espace se trouvant sous la hotte à flux laminaire.
Pour des questions pratiques (microinjection des ovocytes), il sera parfois nécessaire d’équiper la hotte d’un système anti-vibratoire.

D -  L’homéostasie

L’Homéostasie peut être définie comme la constance de l’état d’équilibre idéal pour la culture cellulaire.Elle dépend de 3 facteurs essentiels :la température (voir ci dessus), le pH, l’osmolarité:

Le pH devra être maintenu en permanence entre 7,2 et 7,6 tout au cours des manipulations.
Le mélange-tampon bicarbonate/ac.carbonique est le plus utilisé pour les cultures. Il impose une étuve parfaitement réglée en mélange gazeux. (de 5 à 6% en CO2, selon le milieu de culture utilisé).
Pour des manipulations longues à l’air libre, il est possible d’utiliser des tampons HEPES. Toutefois, après manipulation, il sera nécessaire d’éliminer ce tampon en lavant soigneusement les gamètes ou les embryons dans un milieu de culture conventionnel. 
On peut aussi utiliser un mélange gazeux contenant de l’oxygène, du CO2 et de l’azote. Un mélange «adapté» à chaque situation peut être obtenu par un incubateur «tri-gaz», mais il faut bien reconnaître que la majorité des centres utilise l’air ambiant comme source de gaz, ajusté à 5 ou 6% de CO2 . Dans ces incubateurs le pourcentage d’oxygène se situe autour de 20%.
L’osmolarité doit se situer entre 275 et 285 mOsm/kg  et dépend de 2 facteurs essentiels :
à l’extérieur de l’étuve, elle dépend du temps de manipulation. Une manipulation longue devra donc être effectuée :
- Soit avec un volume de milieu de culture suffisant pour minimiser les effets de l’évaporation (800-900 ul) si l’on utilise la culture en boîte à 4 puits.
- Soit sous huile, ce qui permet d’utiliser des petits volumes de milieux de culture (20-50 ul).
A l’intérieur de l’étuve : elle dépend du degré hygrométrique qui doit
avoisiner les 100% et qui est assuré par une réserve d’eau stérile, à changer régulièrement.

Pour obtenir la constance de l’ensemble de ces paramètres au sein des incubateurs, il est primordial de les ouvrir le moins souvent possible et, donc de disposer de plusieurs incubateurs attribués à des tâches homogènes.

Il est aussi possible de compartimenter les incubateurs soit par un système d’ouverture multiple pouvant garantir un ralentissement des variations à l’ouverture, soit isoler, par exemple, sous cloche, les cultures prolongées.

E - L’environnement

On évitera d’utiliser tout produit (Produit de nettoyage et d’hygiène, spray et bombe anti-odeur, solvant, peinture, alcool...) sans s’être assuré de leur neutralité sur le processus de fécondation ou le développement embryonnaire.
On préférera le matériel stérilisé aux rayons gamma et on proscrira, autant que faire se peut, le matériel à usage unique traité à l’oxyde d’éthylène qui, s’il est utilisé devra être rincé systématiquement avec un liquide isotonique et chaud (37°c.).
On s’assurera aussi qu’il n’existe pas de bouche d’évacuation d’air vicié aux abords du laboratoire.

F - Les modalités de culture

Les différents récipients devant se trouver en contact prolongé avec les milieux de culture, et donc indirectement avec les gamètes et les embryons devront avoir des caractéristiques précises :
- Etre fabriqués avec des matériaux compatibles pour la culture cellulaire (embryotoxicité)
- Etre stérilisés, si possible, par rayonnements gamma et non à l’oxyde d’éthylène
- Etre recouverts si besoin d’un revêtement approprié embryo-compatible pour rendre la surface mouillante, favorable à l’adhésion des cultures cellulaires, d’une part, et défavorable à la sphérisation des microgouttes déposées sous huile, d’autre part.
- Les boîtes de culture en polymères seront utilisables avec les microscopes inversés normaux ou disposant d’un contraste de phase de type « Hoffman ». En revanche pour observer en contraste de phase de type « Nomarski », il faudra impérativement utiliser des boîtes de culture à fond de verre.

Les cultures pourront se faire soit en contact direct avec l’atmosphère. Dans ce cas précis on utilisera des boites de cultures à 4 ou 5 puits prévus a cet effet. Le volume de milieu sera de  800 à 900 microlitres par cupule afin d’éviter au maximum les effets délétères de l’évaporation. 

       

On  pourra aussi utiliser les boites à 4 puits sous huile :
Soit en utilisant des volumes de 400-500 microlitres de milieux de culture recouvert d’huile interessant pour les milieux "globaux" sans manipulation des boîtes pendant 5 jours
Soit en répartissant 2 ou 3 gouttes de 25 à 35 microlitres de milieu, dans chaque puits (moins utilisé).
Plus traditionnellement les cultures se feront sous huile dans le but d’éviter l’évaporation et de conserver des conditions homéostatiques plus favorables lors du déplacement des boites de culture.
Dans ces conditions la répartition du milieu de culture se fera sous forme de microgoutte de l’ordre de 15 à 50 microlitres. Contrairement au système précédent, où chaque cupule peut contenir plusieurs ovocytes, le système sous huile est mieux adapté pour observer l’évolution de chaque embryon ( un par microgoutte).



Les boites de culture GPS® ont la particularité de disposer de micro-cavités moulées dans le fond de la boîte, ce qui  peut être confortable dans certaines conditions de manipulation.

G - Les milieux de culture

Il existe aujourd’hui 3 catégories de milieux de culture :Les milieux « standard » qui peuvent être utilisés à la fois pour la phase terminale des IAC ou pour les fécondations in vitro avec ou sans microinjection, sous réserve de ne pas dépasser 48 heures avant le transfert embryonnaire.Les milieux « séquentiels » qui regroupent des séries de milieux compatibles entre eux mais dont la composition varie en fonction de l’âge de la culture.

Généralement, on utilise un milieu basique pour le temps de la fécondation in vitro. Puis on utilisera par la suite, si l'on veut aller au stade blastocyste, soit des milieux séquentiels dont la composition varie en fonction de l'age de l'embryon,
soit un milieu universel de type « global ® » qui en une seule composition répondent parfaitement bien à tous les stades de l’embryon jusqu’au stade blastocyste.
Le choix des milieux se fera généralement par rapport à des critères de résultats mais aussi par rapport à d’autres critères ( dates de péremption, constance des formulations et des résultats, facilités d’approvisionnement….).

L’huile pour culture
Il existe aujurd'hui sur le marché des huiles « prêtes à l’emploi » détoxifiées et équilibrées. Cependant des centres préfèrent les équilibrer eux même en les saturant avec un milieu de culture ou un milieu salin (Earle’s medium 1X, par exemple)
L’huile est un milieu hostile et qui peut rester en contact avec un milieu salin stérile à 37°C pendant une huitaine de jour. Elle doit être manipulée stérilement à chaque ponction de la couche surnageante
Sa préparation consiste à mettre 1 volume de solution saline ou de milieu de culture avec 4 volume d’huile. Une agitation douce peut être faite à la main par retournements lents. La décantation se fera dans l’étuve à CO2 à 37°C.  Dans ces conditions elle est utilisable après 24 heures, pendant quelques jours.

H -   Conservation des milieux de culture

Ils sont, pour la plupart, conservés autour de 4°C. au réfrigérateur, leur date d’ouverture est notifiée sur chaque flacon pour pouvoir s’assurer de son utilisation dans le cadre des dates limites fournies par le fabricant.
Avant toute utilisation, ils doivent être équilibrés en CO2 et incubés à 37°C, le temps nécessaire ( de 2 a 12 heures suivant les cas ).En revanche, les milieux contenant de l’HEPES doivent être pré-incubés dans une étuve de précision (+ ou - 0,2°C.) à 37°C. sans CO2. Il sont utilisés généralement pour les manipulations longue, hors étuve : microinjection, décoronisation avant ICSI, préparation du sperme…