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Dossier PRO - LES TECHNIQUES EN AMP

FECONDATION IN VITRO ET TECHNIQUES DERIVEES

IV.1  Abréviations :
FIV  : fécondation in vitro conventionnelle
ICSI : Intra cytoplasmic sperm injection  ou fécondation in vitro avec microinjection
IMSI : Morphologically Selected Sperm Injection
SICSI : « scored Intra cytoplasmic sperm injection » ou microinjection avec spermatozoïde choisi à fort grossissement (X6000).C’est en 1978, en Grande Bretagne, que naissait  le premier bébé issu d’une fécondation in vitro.
La technique de FIV, utilisée par R. EDWARDS à l’époque de sa première réussite, est encore utilisée aujourd’hui sans modification significative.
Cette technique dont le but était de permettre aux femmes souffrant essentiellement de stérilité tubaire bilatérale d’avoir des enfants, a été utilisée rapidement dans d’autres indications cliniques, y compris dans le cas de stérilité masculine mineure.
L’utilisation, quelques années plus tard, de l’ICSI (Palermo et Coll. 1992) a permis de traiter efficacement la stérilité masculine à un niveau beaucoup plus élevé en y associant les techniques de ponctions épididymaire et testiculaire.
Aujourd’hui, les nouvelles technologies mises à notre disposition permettent de travailler sous microscope à de très fort grossissement  et donc de mieux choisir les spermatozoïdes à injecter dans le cas ou leur nombre et leur morphologie est très altérés : c’est la MIV (Bartoov et Coll.) ou SICSI.
Chaque technique apporte son lot de particularités mais chacune peut bénéficier des techniques complémentaires communes comme la culture prolongée (allant jusqu’au stade du blastocyste), le hatching (fragilisation de la zone pellucide) ou encore la congélation embryonnaire (conservation à – 196°C.).

IV.2  Matériel et consommable de base
Toutes techniques :
- Pipettes automatiques réglables avec Cônes  stériles (gamma) jaunes ou bleus
- Stripper ® avec embouts calibrés flexibles (120, 135, 150 micromètres de diamètre d’entrée
- Boites de culture 4 puits (culture sans huile) ou boîte de Petri qualité « culture cellulaire »
Pour culture sous huile.
- Milieux de culture et huile à choisir en fonction des procédures utilisés (voir milieux de culture)
ICSI : hyaluronisase 80 UI, PVP ou équivalent.
SICSI : huile à immersion pour objectif X100, boites spéciales à fond en verre  pour observation avec contraste de phase Nomarski.

IV.2.0  Procédures et organisation du travail (Par convention le J0 : « jour zéro » est le jour du recueil ovocytaire)

IV.2.1  La fécondation in vitro conventionnelle - FIVJ -1    
- Contrôle du matériel
- Préparation des boîtes de culture pour le lendemain (37°C, sous CO2)           

J 0  (Ponction ovocytaire - insémination)
- Ponction ovocytaire - Lavage et tri des ovocytes.
- Sélection des spermatozoïdes du conjoint.- Insémination (voir paragraphe VI.2.1.1)
- Préparation des boîtes de cultures pour le lendemain (37°C, sous CO2)
  (milieu de culture classique, ou séquentiel - phase I, ou Global®)

J+1 (pronuclei)
- Dénudage des ovocytes (voir paragraphe VI.2.1.2)
- Observation des pronuclei et tri des zygotes
- Mise en culture en milieu de culture classique (transfert à J+2)
- Si culture prolongée : Mise en culture en milieu séquentiel - phase I, ou en milieu Global®

J+ 2 (embryon 4 blastomères)
- Observation des embryons, tri et choix, si transfert ce jour.
- Congélation embryonnaire éventuelle
  ou culture prolongée.

J+3 (embryon 8 blastomères)
- Observation des embryons, tri et choix, si transfert ce jour.
- Congélation embryonnaire éventuelle
  ou
- Si culture prolongée : Préparation des boîtes de culture pour le
   lendemain : milieu séquentiel - phase II, ou Global®J+ 4, J+ 6 (blastocyste)
- Mise en culture prolongée séquentiel - phase II ou Global®

IV.2.1.1 Insémination

Selon que l’on travaillera en boite de culture à 4 puits sans huile ou en microgoutte sous huile les quantités de spermatozoïdes à inséminer varieront de 100.000 à 150.000 par ml. de milieu de culture utilisé :
Milieu de culture : 1000 microlitres : sp : 100.000 -150.000
Milieu de culture : 25 microlitres : sp : 3000 – 5000

IV.2.1.2  Dénudage des ovocytes

Il existe plusieurs façons d’ effectuer le dénudage des ovocytes :
1 - En utilisant Le STRIPPER®  : avec des tips  en matière souple et calibrés à 150, 135 ou 125 micrométres conçus pour ce travail particulier.
2 - En utilisant des « cônes jaunes stériles » pour pipette automatique, par passages successifs des ovocytes à dénuder dans le cône, en aller-retour. Cette technique est bien souvent insuffisante pour arriver à un résultat satisfaisant.
3 - En utilisant des pipettes Pasteur finement effilées par étirement à la flamme d’un bec à alcool puis terminée par fusion du verre de l’extrémité en petite boule. Ces pipettes boutonnées ont l’avantage d’être fabriquées stérilement et extemporanément, elles peuvent être plus ou moins souples selon les besoins,
Elles permettent un dénudage efficace en les utilisant tangantiellement par petit coups autour de l’ovocyte à décoroniser (sans toucher l’ovocyte). Cette technique demande une prise en main préventive.
Ces techniques sont complémentaires dans de nombreuses situations.
4 - En cas de dénudage difficile (réseau en toile d’araignée ou magma important autour de l’ovocyte, on pourra procéder comme suit :
A – Prendre une boîte de Petri pour culture cellulaire et graver sur le fond de la boîte un réseau de lignes parallèles puis perpendiculaires en utilisant un aiguille stérile à prélèvement sanguin de 0.9 x 25mm (ou 20Gx1’’).
Pour mieux maîtriser la gravure du  fond de la boite emmancher l’aiguille à prélèvement sur une seringue à injection de 1 ml.
Plusieurs dessins peuvent être fait de la même manière dans la même boîte, le but étant   de créer un maillage d’ aspérités pour retenir les dépôts cellulaires.
Mettre du milieu de culture équilibré, à 37°C sur l’ensemble.
B - Sortir l’ovocyte de son milieu avec le moins de matériel cellulaire possible.
et le déposer en appuyant légèrement pour que  l’ensemble se fixe dans un des réseaux dessiné au fond de la boite.
C – Dégager l’ovocyte vers le haut avec une pipette boutonnée (confectionnée en 3).D – remettre aussitôt l’ovocyte dans son milieu de culture définitif avant de recommencer l’opération avec un autre ovocyte.

IV.2.2 
La fécondation in vitro avec microinjection - ICSI

J -1    
- Contrôle du matériel
- Préparation des boîtes de lavage, de culture et de décoronisation pour
  le lendemain  (37°C, sous CO2)

J 0  (Ponction ovocytaire -microinjection)

- Lavage des ovocytes, décoronisation avec la hyluronidase ((voir paragraphe VI.2.2.1), tri des ovocytes
- Sélection des spermatozoïdes du conjoint
- Préparation des boites de microinjection (voir paragraphe VI.2.2.2)
- Microinjection des ovocytes, mise en culture
- Préparation des boîtes de cultures pour le lendemain (37°C, sous CO2)
  (milieu de culture classique, ou séquentiel - phase I, ou Global®)

J+1 (pronuclei)
- Observation des pronuclei et tri des zygotes
- Mise en culture en milieu de culture classique (transfert à J+2)
- Si culture prolongée : Mise en culture en milieu séquentiel - phase I, ou en milieu Global®

J+ 2 (embryon 4 blastomères)
- Observation des embryons, tri et choix, si transfert ce jour.
- Congélation embryonnaire éventuelle
  ou culture prolongée.

J+3 (embryon 8 blastomères)
- Observation des embryons, tri et choix, si transfert ce jour.
- Congélation embryonnaire éventuelle
  ou
- Si culture prolongée : Préparation des boîtes de culture pour le
   lendemain : milieu séquentiel - phase II, ou Global®

J+ 4, J+ 6 (blastocyste)
- Mise en culture prolongée séquentiel - phase II ou Global®
- Transfert de blastocyste et congélation éventuelleVariante : le milieu séquentiel - phase I ou le milieu Global® peut être utilisé dés la mise en culture après la microinjection.

IV.2.2.1  Décoronisation par la hyaluronidaseSchématiquement, il existe deux types de procédures de décoronisation :   
I - l’une se fait dans une boîte à 4 puits, sans huile :     
Cette boîte est préparée 12 heures avant son utilisation, elle contient : Dans le puits 1 : 300 ul de milieu de culture dans lequel on ajoutera extemporanément 300 ul. d’une solution préchauffée de hyluronidase à 80 UI/ml pour ramener l’ensemble à 40 UI/ml.
Dans le puits 2,3,4 : 600 ul. de milieu de culture avec ou sans Hepes selon les habitudes du centre. Le début de la décoronisation sera pratiquée dans le puits 1 en utilisant des  « cônes jaunes stériles » pour pipette automatique.
On procédera par aspirations et refoulements successifs des ovocytes et de leur cumulus jusqu’à obtenir le décollement des cellules de la corona radiata.
Puis on utilisera ensuite, pour parfaire le nettoyage et rincer les ovocytes décoronisés dans les puits 2,3,4 :
- Soit des pipettes pasteurs éffilées et pré - calibrées à 125 - 130 micromètres.
- Soit Les TIPS pour STRIPPER® : embouts en matière souple et  calibrés à 150, 135 ou 125 micromètres  et conçus pour ce travail particulier. (Leur souplesse évite les blessures sur la partie externe de l’ovocyte (Z.P.).

               

II - L’autre se fait dans une boite de Pétri, sous huile pré-incubée.           
Cette boite est préparée environ 2 à heures avant son utilisation, elle contient :
1 goutte de 300 ul de hyluronidase titrée à 40 UI/ml (voir au dessus).
5 à 6 gouttes de 20 à 30 ul. de milieu de culture tamponné bicarbonate ou HEPES, selon procédure, pour les différents lavage avant incubation, en attente de la microinjection.

IV.2.2.2  Préparation des boites de microinjection

Ces boîtes vont être manipulées assez longtemps dans des conditions hostiles.
Pour ces raisons, leur constitution pourra varier d’un utilisateur à l’autre en fonction de la rapidité d’exécution des micro-manipulations. 

Pour une bonne tenue du pH, Il sera On pourra aussi utiliser des milieux de culture comportant un tampon Hepes, plutôt qu’un tampon carbonate.
Le nombre d’ovocytes à injecter dans la même boîte pourra varier de 3 à 6, selon la dextérité de l’utilisateur.
Ces boîtes sont préparées 2 heures environ avant utilisation sous huile, de manière à être gazées convenablement à 37°C. avant utilisation.

IV.2.2.3  Technique avec goutte de Polyvinylpyrrolidone (PVP) ou équivalent.

Une goutte de milieu de culture, étendue en rectangle, est faite pour recevoir un échantillon de sperme provenant d’une sélection effectuée à partir d’un swim-up ou d’une technique par gradient de concentration.
Les spermes les plus mobiles vont alors se retrouver à la périphérie de la goutte. Ils seront sélectionnés et prélevés avec la micropipette de micro-injection puis transportés dans le PVP avant d’être injectés dans les ovocytes

IV.2.2.4   Technique avec pont liquidien.       

le PVP est étalé en rectangle, à raison de 8 microlitres sur 0,5 cm2 environ, de manière à obtenir une couche relativement fine.
Une très petite goutte de milieu de culture (3-4 ul) est déposée à environ 0,5 cm du PVP. On établit ensuite, avec l’embout du cône jaune, un pontage entre la goutte d’IVF et le PVP.
Une fois recouverte d’huile, la boîte est incubée 2 heures à 37°C. sous 5% de CO2, avant utilisation.Quoique le PVP soit encore très utilisé aujourd’hui, pour des raisons de commodité, certains centres utilisent aussi des produits réputés plus «naturel» comme l’acide hyaluronique ou ses dérivés.Les spermatozoïdes seront déposés sur l’empreinte de la goutte de milieu de culture qui est à l’origine du pont liquidien.
Ils migreront alors d’un milieu très fluide vers un milieu plus visqueux, en suivant, pour les meilleurs d’entre eux, le bord du PVP.
Après injection, les ovocytes seront lavés dans un milieu sans HEPES avant d’être mis en culture.

IV.2.2.5   Préparation du sperme

Dans les cas normaux, le sperme sera sélectionné avec les méthodes habituelles ( gradient de densité ).
Dans d’autres cas, où il s’agira de sperme épididymaire ou de sperme testiculaire qu’il faudra le traiter de manière différente selon la richesse en spermatozoïdes du prélèvement. Dans le cas d’un prélèvement testiculaire une «extraction» des spermatozoïdes pourra s’effectuer en s’aidant de lames de verre stérilisées de manière à les dissocier de la pulpe.
En cas de présence de spermatozoïdes immobiles, on pourra dépister ceux qui sont vivants en utilisant une technique de réactivation  à la pentoxiphyline, ou en utilisant directement le test de Hoss lors de la microinjection.

IV.2.2.6   Montage et réglage des micropipettes

Pour pouvoir neutraliser le mouvement du spermatozoïde en fragilisant le flagelle, il faut avoir un angle d’attaque bien calculé.
Si nous prenons le cas d’une pipette de microinjection dont l’angle est de 30°, par exemple. Cette pipette roulera sur le flagelle sans le blesser si elle reste parallèle à la platine du microscope.


Si on augmente l’angle d’incidence (de +2 à +4 °) l’extrémité de la pipette pourra alors attaquer le flagelle et immobiliser le sperme .

Si on augmente l’angle d’incidence (de +2 à +4 °) l’extrémité de la pipette pourra alors attaquer le flagelle et immobiliser le sperme .

IV.2.2.7   Procédure de microinjection
Avant de procéder à la microinjection, il sera nécessaire d’orienter l’ovocyte en fonction de son globule polaire. Celui ci devra effectivement se présenter en haut ou en bas d’un axe vertical médian, ceci afin de diminuer les risque de faire la microinjection au niveau du fuseau méiotique dont les probabilités de présence sont reportées sur l’image qui suit et qui font référence au travaux de Hardason T. et coll.

Une fois la pipette positionnée, le sperme doit avancer régulièrement dans celle ci. Si sa vitesse augmente, plutôt que de la ralentir en procédant à un retour en arrière il vaut mieux planter doucement la micropipette dans la zone pellucide ce qui aura pour effet de boucher partiellement l’orifice et de ralentir le flux. On jouera ensuite sur la vitesse jusqu’à l’injection du sperme dans l’ovocyte
La micropipette est alors introduite assez rapidement dans l’ovocyte jusqu’à dépasser légèrement l’axe médian. On pratique une aspiration modérée du cytoplasme jusqu’à rupture de la membrane ovocytaire (formation d’un cône d’aspiration) puis on injecte à nouveau le spermatozoïde jusqu’à son dépôt hors de la  pointe de la pipette.
La pipette est alors ressortie délicatement en s’assurant que le spermatozoïde reste bien à son point du dépôt.

IV.2.2.8 
La fécondation in vitro avec microinjection de sperme choisi à un fort grossissement (IMSI ou SICSI)

La microscopie électronique avait déjà permi, il y a quelques dizaines d’années, de constater la présence anormale de vacuoles dans la tête de certains spermatozoïdes.

En 2003, Bartoov et coll.décrivait une nouvelle technique d’observation des spermatozoïdes : la MSOME ou Motile Sperm Organelle Morphology Examination. suivi par un article de Berkovitz et coll. en 2005.
Dans ces publications, l’observation se fait à un grossissement de 1000 fois (oculaire X10, Objectif à immersion X100) en contraste de phase Nomarski et est relayée par une camera numérique qui permet l’agrandissement de l’image sur un écran de télévision jusqu’à 6500 fois environ. Pour pouvoir utiliser cette technique en routine, il fallut rapidement trouver un moyen de choisir les «bons spermatozoïdes».
En principe, le bon spermatozoïde est celui qui donne les meilleures chances de grossesse (à terme), Nous voyons donc quel travail reste à faire pour valider définitivement la technique, même si l’impression générale de ceux qui l’utilisent déjà est favorable.
Récemment G.Cassuto et coll.** ont proposé une méthode de sélection des spermatozoïdes appuyée sur une étude entre la classe des spermatozoïdes (I, II, III) et leur aptitude à donner des embryons de bonne qualité (blastocyste expansé).

La SICSI ou «scored intracytoplasmic sperm injection» est une microinjection  dans laquelle les spermatozoïdes sont analysés préalablement, un par un puis classés selon une grille de valeur (grille HVB) - Head, Vacuole, Base.Une fois les spermatozoïdes choisis au grossissement X6000, ils sont micro-injectés au grossissement habituel de X200 ou X400 et on poursuit alors la culture comme dans la procédure d’ICSI.

IV.3  L’éclosion assistée -  Hatching

La zone pellucide est la grosse enveloppe qui entoure la partie centrale de l’oeuf.
Dans certain cas elle est trop épaisse (Cohen et Coll. 1982-1992) ou trop dure, chez les personnes âgées ( Loret  de Lola et Coll. 1997) pour que l’embryon puisse s’en extraire et continuer son développement dans l’utérus.Autres causes possibles d’échec à l’éclosion naturelle :
Z.P. durcies par des traitements divers :
culture in vitro ( De felici and Coll 1982),
congélation embryonnaire (Caroll et Coll. 1990,
action de la hyluronidase (Drobnis et Coll 1998)

L’éclosion assistée consiste à fragiliser cette enveloppe pour qu’elle se brise plus facilement.
On considère qu’une zone pellucide est plus épaisse que la normale au dessus de 16 micromètres.
La fragilisation de la Z.P. peut s’effectuer de plusieurs manière. :
La plus sophistiquée consiste en l’utilisation d’un laser qui permet une fragilisation précise et bien contrôlée.
En dehors de cette technique, on peut fragiliser la Z.P.  :
- Soit en faisant agir très rapidement une solution de Tyrode acidifiée (pH 2,3)

- Soit en pratiquant une « usure » de la zone pellucide en la frottant contre une micropipette de contention, après avoir piqué l’ovocyte contraint avec une aiguille de hatching.

L’éclosion assistée peut être envisageable chez les patientes ayant déjà eu au moins 3 échecs d’implantation après un transfert normal, surtout quand l’épaisseur de la Z.P. est supérieure à 16 micromètres, a fortiori s’il s’agit d’embryons décongelés, ou d’une patiente plus âgée.

Devant les résultats incertains en terme de peuves d’éfficacité, cette technique est peu utilisée aujourd’hui.